۷-لوله را ورتکس کرده و سپس به مدت ۱۵ دقیقه در ۵۶ درجه سانتی گراد قرار داده و به دنبال آن ۱۵ دقیقه در ۸۵ درجه سانتی گراد انکوبه شد.
۸-۵۰۰ میکرولیتر RNX-plus افزوده و لوله را ۱۰ بار وارونه کرده و سپس ۵ ثانیه ورتکس شد.
۹- لوله به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق قرارداده شد.
۱۰-۲۰۰میکرولیتر کلروفرم به لوله افزوده و۱۵ ثانیه ورتکس گردید،سپس لوله به مدت ۵ دقیقه روی یخ قرار داده شد.
۱۱-لوله به مدت ۱۵دقیقه در ۱۲۰۰۰ g با دمای ۴ درجه سانتیگراد سانتریفیوژگردید.
۱۲-فاز آبی (رویی) را به لوله جدید منتقل کرده و هم حجم آن ایزوپروپانول سرد اضافه شد.
۱۳-لوله را۱۰ بار وارونه کرده، سپس۱ساعت(یا over night) در۲۰- درجه قرارداده شد.
۱۴-لوله به مدت ۱۵ دقیقه در۱۲۰۰۰ g سانتریفیوژ و مایع رویی دور ریخته شد.
۱۵-۱۰۰۰میکرولیتر اتانول سرد۷۰% به لوله افزوده، لوله ۱۰ بار وارونه گردید.
۱۶-سپس به مدت ۸ دقیقه در۷۵۰۰ g سانتریفیوژ شد.
۱۷-مایع رویی را دور ریخته سپس در دمای محیط قرار داده شدتا الکل آن بپرد.
۱۸-۳۰ میکرولیتر DEPC، به لوله افزوده، سپس ورتکس کرده و در۲۰- نگهداری شد.
۳-۹-آشکارسازی کمی RNA توسط دستگاه اسپکتروفتومتر
ابتدا با آبDEPC (موجود در محلول (RNA، دستگاه صفر گردید. به این منظور۱۰۰میکرولیتر از آب DEPC،درکوت مخصوص دستگاهEppendrof قرار داده شد.سپس نمونه ها به نسبت۲به۹۸ میکرولیتر با DEPC رقیق و جذب نوری (OD) نمونه‏ها در طول موج‏ مشخص شده (ssRNA) سنجیده شد. طول موج۲۸۰ نانومتر مربوط به پروتئین و طول موج۲۶۰ نانومتر مربوط به اسید نوکلئیک می باشد.نسبت طول موج۲۶۰به۲۸۰،بیانگر نسبت اسید نوکلئیک به پروتئین است. عدد۲۸۰/۲۶۰ میزان خلوص RNA استخراج شده را مشخص می کند.اگر این عدد بین ۹/۱– ۷/۱ باشد RNA دارای کیفیت مطلوب می‏باشد.هر چه این عدد پایین‏تر باشد میزان آلودگی با پروتئین یا مواد آروماتیک مانند فنل بیشتر است.
۳-۱۰-سنتز cDNA
سنتز cDNA با شرایط زیر صورت گرفت:
مواد لازم برای سنتز cDNA، شامل g/µlµ ۲/۰ Random Hezamer) )، g/µlµ ۵/۰ (پرایمر Oligi dT ) و U 100 آنزیم MMULV ،۱۰ ماکرولیتر RNA به هر لوله افزوده طوری که حجم نهایی واکنش در نهایت ۲۰ ماکرولیتر بدست آمد. نمونه ها ۵ دقیقه در ۶۵ درجه سانتی گراد قرارداده شد. سپس بلافاصله در یخ گذاشته شد. لوله ها به مدت ۱ ساعت در ۴۲ درجه سانتی گراد قرار داده شد.

۳-۱۱-ژن کنترل داخلی
کنترل داخلی یا house keeping gene یا refrence gene یا standard gene،ژنی است که بیان دائمی و ثابت دارد.برای اندازه گیری کاهش یا افزایش بیان ژن هدف،بیان آن را با بیان ژن کنترل داخلی مقایسه می کنند.در این مطالعه از گلیسر آلدهید فسفات دهیدروژناز به عنوان کنترل داخلی استفاده گردید.چون ژن GAPDH به صورت پایدار و در اکثر سلول ها و بافت ها بیان می شود بنابراین به عنوان یک house keeping gene مطرح شده است و توسط محققان زیست شناسی،در واکنش هایی مثل Real timePCR وRT PCR مورد استفاده قرار می گیرد.
۳-۱۲-پرایمر های ویژه Real Time PCR
توالی ژن گیرنده استروژن آلفا(ESR1) و گلیسرآلدهید ۳-فسفات دهیدروژناز(GAPDH) که به عنوان کنترل داخلی استفاده شده بود از سایت NCBI بدست آمد. سپس توسط برنامهPrimer Express پرایمرهای اختصاصی طراحی گردید.در نهایت پرایمرها ی طراحی شده،توسط NCBI و برنامه Gene Runner،Blast گردیدند تا دقت و اختصاصیت آنها مورد بررسی قرار گیرد. توالی و مشخصات پرایمرها در جدول (۳-۲)نمایش داده شده است.
جدول (۳-۲) توالی و مشخصات پرایمرهای ویژه Real timePCR