مارکرهای DNA در یک تقسیمبندی کلی به دو گروه مارکرهای مبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز و مارکرهای غیرمبتنی بر واکنش زنجیرهای پلیمراز تقسیم میشوند.
۱-۵-۱-۲-۲-۱- مارکرهای DNA غیرمبتنی برPCR
مارکرهای غیرمبتنی برPCR ، مارکرهایی هستند که بدون استفاده از واکنش زنجیرهای پلیمراز تولید میگردند واساس کار آنها بر پایه برش قطعات DNA ژنومی با بهره گرفتن از آنزیمهای برشی استوار میباشد.
RFLP :Restriction Fragment Lenghth Polymorphism
چندشکلی در طول قطعات حاصل از برش به وسیلهی آنزیمهای محدودگر، مهمترین مارکر گروه مارکرهای غیرمبتنی برPCR می‌باشد.
این تکنیک در اوایل دهه ۱۹۸۰ معرفی گردید، چندشکلی به وجود آمده در اثر هیدرولیز DNA به وسیله یک اندونوکلئاز محدودگر، چندشکلی پس از دو رگه شدن یک کاوشگر نشاندار شده با قطعات جدا شده روی ژل الکتروفورز و انتقال روی یک غشاء آشکار میشود(تکنیک سادرن).
۱-۵-۱-۲-۲-۲- مارکرهای DNA مبتنی برPCR
مارکرهای DNA مبتنی بر PCR مارکرهائی هستند که استفاده از آنها منوط به استفاده از محصولPCR میباشد. با بهره گرفتن از تکنیک PCR در این مارکرها، دیگر نیازی به تهیه کاوشگر و انجام هیبریداسیون آن با قطعاتی DNA ژنومی برای آشکارسازی تفاوتها نبوده و پلیمورفیسم به شیوه دیگری بررسی می‌گردد.

اساس کار در این گروه از نشانگرها بر پایه استفاده از یک توالی الیگونوکلئوتیدی به عنوان پرایمر برای تکثیر قطعه خاصی از DNA استوار می‌باشد.
از جمله مهمترین مارکرهای این گروه میتوانISSR , SSR , DAF , AFLP , RAPD را نام برد.
RAPD:Random Amplified Polymorplic DNA
DNA چندشکلی تکثیر شده تصادفی که اختصاراً رپید نامیده میشود، یکی از مارکرهای این گروه است. دراین روش قطعاتی از ژنوم نمونه های مختلف بطور تصادفی تکثیر شده و سپس قطعات تکثیر شده توسط الکتروفورز بر روی ژل آگارز از یکدیگر جدا میگردند. و برای تکثیر DNA بوسیلهPCR از یک پرایمر ۸ تا ۱۰ نوکلئوتیدی با توالی دلخواه و تصادفی استفاده میشود.
Amplified Fragment Length Poly morphism : AFLP
تفاوت طول قطعات حاصل از تکثیر که بصورت اختصاری AFLP نامیده میشود، گروه دیگری از مارکرهای مبتنی برPCR میباشد. با این روش مارکرهایی تولید میشوند که مزایای RAPD , RFLP را تواماً دارا میباشد. پایه و اساس این تکنیک که اولین بار در سال ۱۹۹۵ ارائه گردید، تکثیر انتخابی برخی قطعات از بین تمام قطعات برش یافته DNA ژنومی می‌باشد.
DAF:DNA Amplification Fingerprinting
یکی دیگر از نشانگرهای مبتنی بر PCR که از نظر اصول تکنیکی بسیار شبیه RAPD می‌باشد،DAF یا انگشت نگاری با DNA تکثیر شده می‌باشد.
SSR: Simple Sequence Repeats
ردیفهای کوتاه تکرار شونده دستهای دیگر از مارکرهای مبتنی بر PCR می‌باشند که بنام میکروساتلایتها نیز خوانده میشوند. استفاده از این تکنیک بر پایه این واقعیت است که یک سری توالیهای ساده و کوتاه دو تا پنج نوکلوتیدی به صورت تکراری در ژنوم بسیاری از موجودات یوکاریوتی وجود دارند. اساس کار مارکر SSR را که یک مارکر چنداللی و همبارز بوده و تنوع درون مکانی را نشان میدهد، تشکیل میدهند.
Inter Simple Sequence Repeats :ISSR
نشانگرهای ISSR از جمله نشانگرهای مبتنی بر PCR هستند که مزایای هر سه نشانگر SSR, AFLP,RAPD را دارا و فاقد معایبی از قبیل تکرارپذیری کم و هزینه بالا میباشد(سانتالا، ۱۹۸۸).
از این نشانگر به منظور تکثیر قطعهای از DNA بین دو ریزماهواره که در ژنوتیپ یک گونه در حالت عکس یکدیگر قرار گرفتهاند، استفاده میشود.
این نشانگر تا حدودی مشابه نشانگر RAPD میباشد با این تفاوت که در اینجا آغازگرها همان توالی ریزماهواره میباشند که در یک انتها َ۳ یا ۵َ به ۴-۲ بازپورین یا پریمیدین متصل شدهاند.
در واقع همین مسئله مزیت این نشانگر نسبت به SSR و RAPD را موجب شده است چرا که مشکل پرایمرهای تصادفی در RAPD و انجام کلونینگ و توالی یابی ناحیه متصل به ریزماهوارهها و طراحی پرایمر در SSR که بسیار دشوار و هزینهبر است را برطرف نموده است. نحوه توارث آن همانند RAPD غالب است و در نتیجه هتروزیگوسیتی را نشان نمیدهند.
همانگونه که میدانیم ریزماهوارهها اغلب غیرعملکردی هستند و استفاده از نشانگرهای SSR فقط به شناسایی ارقام یا ردهبندی گونهای محدود میشود اما نتایج آزمایشها نشان میدهد نشانگر ISSR به عنوان ابزاری مفید در نقشهیابی ژنتیکی و انگشت نگاری DNA قابل استفاده است.
ISSR نشانگر مولکولی با کاربرد آسان است که بهDNA الگوی کمی نیاز دارد. این روش دادههایی حاوی اطلاعات مفید، سریع قابل تکرار و ارزان ارائه مینماید.
۱-۶- دلایل استفاده از نشانگرهای مولکولی در زمینه گیاهان دارویی
نشانگرهای مولکولی دارای کاربرد فراوان در اصلاح گیاهان دارویی هستند. فاکتورهایی همچون خاک و شرایط آب و هوایی، بقای یک گونه خاص و همچنین محتوای ترکیب دارویی گیاه را تحت تاثیر قرار میدهند. در چنین حالاتی علاوه بر اینکه بین ژنوتیپهای مختلف یک گونه تفاوت دیده میشود از لحاظ ترکیب دارویی فعال نیز اختلاف وجود دارند.
در هنگام استفاده تجاری از گیاه دو فاکتور، کیفیت نهایی داروی استحصالی گیاه را تحت تاثیر قرار می‌دهند.
تغییر محتوای یک ترکیب دارویی خاص در گیاه مورد نظر
اشتباه گرفتن یک ترکیب دارویی خاص با اثر کمتر که از گیاهان دیگر بدست آمده است به جای ترکیب دارویی اصلی که از گیاه اصلی به دست میآید.
چنین تفاوتهایی، مشکلات زیادی را در تعیین و تشخیص گیاهان دارویی خاص با بهره گرفتن از روش‌های سنتی (مرفولوژیکی و میکروسکوپی) به دنبال خواهد داشت.
بنابراین با توجه به مشکلات موجود در زمینه شناسایی گیاهان دارویی با بهره گرفتن از روش های سنتی و با توجه به پیشرفت محققین در زمینه ایجاد نشانگر DNA، استفاده از یک تکنیک نوین میتواند ابزاری قدرتمند در استفاده کارا از گونه های موثر دارویی محسوب شود.
از جمله مزایای این نشانگرها، عدم وابستگی به سن و شرایط فیزیولوژیکی و محیطی گیاهان دارویی است که این فاکتورها نقش مهم و محدود کنندهای در تولید و تکثیر گیاهان دارویی دارند. پروفیلی که از انگشت نگاری DNA یک گیاه دارویی بدست میآید، کاملاً به همان گونه اختصاص دارد که در اصلاح و تکثیر یک گونه برتر بسیار حائز اهمیت است. همچنین برای استخراج DNA به عنوان ماده آزمایشی در آزمایشات نشانگر مولکولی، علاوه بر بافت تازه، میتوان از بافت خشک نیز استفاده نمود واز این رو، شکل فیزیکی نمونه برای ارزیابی آن گونه اهمیت ندارد.
نشانگرهای مختلفی بدین منظور ایجاد شدهاند که از آن جمله میتوان به روش های مبتنی بر هیبریداسیون (مانند RFLP)، روش های مبتنی بر PCR (مانند AFLP) و روش های مبتنی بر توالییابی (مانندITS ) اشاره کرد (قاسمی دهکردی، ۱۳۸۰).
۱-۷- اهداف مشخص تحقیق
در این پژوهش اهداف ذیل دنبال میشود:
بررسی و مطالعه وقوع تنوع سوماکلونال در نمونه های حاصل از کشت بافت گیاه بارهنگ با بهره گرفتن از نشانگرهای ISSR
بررسی تاثیر نوع ریزنمونه، ترکیبات محیط کشت و تعداد واکشت بر میزان پلیمورفیسم در نمونه های گیاه بارهنگ
فصل دوم
بررسی منابع
۲-۱- بررسی مرور منابع
میرمعصومی(۲۰۰۱)، تولید موسیلاژ در کشت بارهنگ نیزهای(Plantago Lanceo lata) را مورد مطالعه قرار داد. در این مطالعه قطعات جدا کشت ریشه و دانه رستهای ده تا بیست روزه گیاه بارهنگ نیزهای، روی محیطهای کشت پایه B5, NT,MSH,MS با غلظت‌های مختلف از تنظیم کنندههای رشد کشت گردیدند. بهترین محیط کشت از نظر القاء کالوس در محیط کشت MSHI محتوی ۴/۰ میلیگرم در لیتر۲,۴-D گزارش شد. بیشترین مقدار موسیلاژ در محیط کشت MSHII محتوی۱/۰ میلیگرم در لیتر KIN تولید شد. مقدار موسیلاژ در محیطهای کشت مختلف بین ۴/۱۰ درصد تا ۷۳/۱۴ درصد وزن خشک متغیر بود. همچنین، مقدار موسیلاژ کالوس تقریباً ۳ برابر بیشتر از بذر و ۵/۱ برابر بیشتر از ریشه و برگ برآورد شد.
میرمعصومی(۱۳۷۱)، با بررسی تولید موسیلاژ در تیره بارهنگ در شرایط کشت بافت و کشت در مزرعه گزراش کرد که از نظر نقش محیط کشت در تولید موسیلاژ میتوان ۴ محیط را در نظر گرفت، بطوری که محیطهای MSH-2 تا MSH-4 بهترین گروه بوده و محیطهای B5-2، NT-1، MS-2، NT-4 و ۴-B5 ضعیفترین گروه راتشکیل میدهند. تولید موسیلاژ کالوس بارهنگ در محیط MSH-3 بالاترین است و ۵/۳۲ درصد وزن خشک کالوس را موسیلاژ خام تشکیل میدهد ، میتوان گفت در این تحقیق، تولید موسیلاژ خالص کالوس بارهنگ به حداکثر ۲۲ درصد رسیده است.
رحیمی و همکاران(۱۳۹۰)، تنوع ژنتیکی و برآورد وراثت پذیری عملکرد و موسیلاژ دانه در اکوتیپ‌های بارهنگ را مورد ارزیابی قرار دادند، نتایج تجزیه واریانس نشان داد که در بین اکوتیپها تنوع معنیداری از نظر صفات مورفولوژیک و عملکرد دانه وجود دارد. ضرایب تغییرات ژنتیکی و فنوتیپی وزن موسیلاژ در یک گرم به ترتیب ۳۲/۲۰ درصد و ۸۸/۲۰ درصد برآورد گردید. نتایج همبستگی نشان داد که وزن موسیلاژ با مقدار تورم در یک گرم(۷۹/۰-= r) همبستگی منفی و با وزن هزار دانه(۶۹/۰=r) و شاخص برداشت (۶۶/۰r=) همبستگی مثبت و معنی داری داشت. همچنین، نتایج نشان داد که در بین صفات مورد بررسی ضریب تغییرات ژنتیکی و فنوتیپی برای کاتالاز بیشترین ۹۵/۴۶= CVg درصد و ۹۸/۴۷CVP= درصد برای آسکوربیک پراکسید از ۲۳/۵=CVg درصد و ۲۲/۶=CVP درصد کمترین بود. در بین صفات مورد ارزیابی کلروفیل کل بیشترین(۲۴/۹۸ درصد) و آسکوربیک پراکسید از(۷۷/۷۰ درصد) کمترین وراثتپذیری در بین صفات بیوشیمیایی را داشتند.
ابراهیمزاده و همکاران(۱۳۷۵)، در بررسی تشکیل کالوس و تولید موسیلاژ در قطعات جداکشت برگ و ریشه چهار گونه بارهنگ گزارش کردند، قطعات برگ و ریشه چهار گونه بارهنگ تخممرغیP.ovata) ( بارهنگ بزرگ (P.major) بارهنگ کلکی (P.psyllium) و بارهنگ نیزهای(P.lanceolata) در پنج محیط کشت پایه MSH, MSV , B5, NT, MS با غلظتهای هورمونی متفاوت کشت گردید و شرایط مناسب برای تشکیل کالوس مشخص شدند. بارهنگ کلکی، بیش از گونه های دیگر توانایی تشکیل کالوس از خود نشان داد و گونه های دیگر به ترتیب زیر تخم مرغی، نیزهای و بزرگ در گروه های بعدی قرار گرفتند. مناسبترین محیط برای کشت برگ و ریشه به ترتیب اندازه کالوس از بزرگ به کوچک، NT-1 برای بارهنگ کلکی (۹۷/۵ میلیمتر) NT-1 برای بارهنگ تخممرغی(۹۱/۴ میلیمتر) MSH برای بارهنگ نیزهای(۱۷/۴ میلیمتر) و B5-2 (38/2 میلیمتر) برای بارهنگ بزرگ است. مناسبترین محیط برای کالوسها حاصل از برگ و ریشه، و به ترتیب میانگین مقدار موسیلاژ از بالا به پایین MSH-3 برای بارهنگ بزرگ(۵/۲۰ درصد)، NT-3 برای بارهنگ نیزهای(۵۴/۱۲ درصد) است. بنابر این، توانایی تولید موسیلاژ در کالوس بالا بوده و از کشت در شیشه نیز میتوان برای تولید موسیلاژ استفاده نمود. بعلاوه بارهنگ کلکی با کشت در شیشه تولید بیشتری از خود نشان میدهد و به گونه های بارهنگ تخممرغی و بارهنگ بزرگ نزدیکتر میشود.
ساریهان و همکاران(۲۰۰۵)، بررسی تولید ساقه باززایی شده در (Plantago Afra L.) انجام شد. تولید ساقه باززایی شده در شرایط درون شیشهای از هیپوکوتیل و کوتیلدون کشت شده از دانه های یک هفتهایpsyllium درمحیط MS که حاوی مقادیر مختلف KIN+IBA, TDZ+IBA, BAP+IBA, BAP+NAA بود بوجود آمدند.تولید ساقه باززایی شده در بالاترین مقدار تولید از هیپوکوتیل(۱۷/۲۳) در محیط MS حاویM IBA μ۹۸/۰ وμM TDZ ۹۱/۰ مشاهده گردید.ساقه های باززایی شده در MS حاویM IBA μ ۹۸/۰- μM TDZ ۹۱/۰ و در ظرف حاوی mM NAA 22/3 بهترین ریشهزایی را دارا بودند. گیاهان ریشه‌دار به خاک منتقل شده و پس از وفق یافتن به منظور گل دادن و ایجاد دانه به گلخانه منتقل شدند.
رضوی و همکاران (۱۳۸۸)، در یک تحقیق خواص مهندسی دانه بارهنگ، در یک سطح رطوبتی تعیین گردید به طوریکه متوسط جرم هزار دانه mg 147 ومیانگین دانسیته توده، دانسیته حقیقی و درصد تخلخل به ترتیبkg/m³ ۸/۷۰۱ و kg/m³1283 و %۳/۴۵ محاسبه شد. ضریب اصطکاک استاتیک برای ۵ سطح تخته چند لایه، لاستیک، شیشه، فایبرگلاس و ورق گالوانیزه اندازه گیری شد و مقادیر میانگین آن به ترتیب ۵۱/۰، ۴۶/۰، ۳۶/۰، ۳۵/۰، ۳۳/۰ تعیین شد. زاویه ریپوز تخلیه و زاویه ریپوز پرکردن به ترتیب ۱/۳۶ و ۱/۱۸ درجه و سرعت حد M/S 86/1 به دست آمد توسط پردازش تصویر میانگین طول و عرض و سطح به ترتیب mM 9/778 و mM 8/514 و MM² ۱۰^۴ × ۶۳۴۴/۲۹و میانگین ضریب کرویت، ضریب گردی، نسبت نما به ترتیب ۹۹۶/۰ ، ۶۲/۰ و ۵۲/۱ بدست آمد.
راهنشان (۱۳۸۶)، پاسخهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی قطعات جداکشت چند گونه بارهنگ تحت تنش شوری Nacl را مورد مطالعه قرار دادند. وزن تر و خشک کالوس، P.ovata با افزایش غلظت نمک کاهش پیدا کرد. در گونهP.psyllium وزن تر و خشک کالوس‌ها در ۷۵ میلی مولار افزایش معنی داری را نشان داد. محتوای موسیلاژ در کالوس‌های حاصل P.ovata با افزایش شوری افزایش یافت. در کالوس‌های ریشه‌ایP.psyllium تنها در غلظتهای بالای Nacl محتوای موسیلاژ افزایش نشان داد.
اردکانی و همکاران(۱۳۸۳)، بررسی تولید و نگهداری کشت سلولی گیاه بادرنجبویه و مقایسه متابولیت‌های تولید شده در کالوس با گیاه کامل را انجام دادهاند. نتایج بدست آمده نشان داد که بیشترین درصد ترکیبات موجود در اسانس گیاه را سیترونلال، نرال، ژرانیال و بتاکاریوفیلن تشکیل میدهند. در مقابل، کالوس هیچ گونه ترکیب اسانسی تولید نکرد. اما بررسی مقدماتی روی عصاره کالوس نشان داد که سلولها، تانن تولید کردهاند.